Artículo
El Diario EMBO publicación anticipada Internet el 22 de octubre de 2010; doi: 10.1038/emboj.2010.264
Sin perjuicio de las categorías: la cromatina y transcripción | Biología Molecular de DiseaseCrucial función de la histona deacetilasa 1 para la diferenciación de los teratomas en ratones y Open humansEMBO
Sabine Lagger1, 5, Dominique Meunier1, 5, Mario Mikula2, 6, Reinhard Brunmeir1, 7, Michaela Schlederer3, Matthias Artaker1, Oliver Pusch4, Gerda Egger3, Astrid Hagelkruys1, Wolfgang Mikulits2, Georg Weitzer1, W Ernst Muellner1, Martin Susani3, Lukas Kenner3 , 8 y cristiana Seiser1, 8
Departamento de Bioquímica Médica Max F. Perutz Laboratorios de la Universidad Médica de Viena, Biocenter de Viena, Viena, Austria
Instituto para la Investigación del Cáncer de la Universidad Médica de Viena, Viena, Austria
Clínica Instituto de Patología de la Universidad Médica de Viena, Viena, Austria
Centro de Anatomía y Biología Celular de la Universidad Médica de Viena, Viena, Austria
Correspondencia a:
Lukas Kenner, Instituto Clínico de Patología de la Universidad Médica de Viena, Währinger Gürtel 18-20, Viena, Austria A-1090,. Tel:. +43 140 400 4526, Fax: +43 140 400 3707, E-mail: @ lukas.kenner meduniwien.ac.at
Seiser cristiana, Bioquímica Médica Max F. Perutz Laboratorios de la Universidad Médica de Viena, Biocenter Viena, Dr. Bohrgasse 2.9, Viena Austria A-1030,. Tel:. +43 142 776 1770, Fax: +43 14 277 9617, E-mail: @ christian.seiser meduniwien.ac.at
5These autores contribuyeron igualmente a este trabajo
dirección 6Present: Instituto de Genética Médica, Universidad Médica de Viena, Viena, Austria
dirección 7Present: Singapur Instituto de Ciencias Clínicas
autores 8Cosenior
Recibido el 8 de abril de 2010; aceptado 28 de septiembre 2010
Histona deacetilasa (HDAC) inducir la detención del ciclo celular, diferenciación o apoptosis en células tumorales y, por tanto, con la promesa reactivos contra el cáncer. Sin embargo, la HDAC isoformas específicas que median estos efectos aún no son identificados. Para explorar la función de HDAC1 en la proliferación y la génesis tumoral del tumor, se estableció un modelo experimental con teratoma de tipo salvaje y las células embrionarias HDAC1 deficiente madre. teratomas HDAC1 deficiente no mostró diferencias significativas en el tamaño en comparación con teratomas de tipo salvaje. Sorprendentemente, la pérdida de HDAC1 no estaba vinculada sólo a aumento de la apoptosis, sino también a mejorar significativamente la proliferación. estructuras epiteliales demostraron una reducción de la diferenciación como supervisados por oct3 / 4 de expresión y localización cambiado la E-cadherina y de expresión que aparecen regulados hasta de SNAIL1, un regulador de la plasticidad de las células epiteliales. Los niveles crecientes del regulador transcripcional SNAIL1 son cruciales para la proliferación y diferenciación mayor reducción de teratoma HDAC1 deficiente. Es importante destacar que el análisis de los teratomas humanos reveló un vínculo similar entre la pérdida de HDAC1 y malignidad del tumor mayor. Estos resultados revelan un papel de la novela para HDAC1 en el control de la proliferación tumoral e identificar HDAC1 como marcador potencial de los teratomas benignos.
Palabras clave: tratamiento del cáncer, la cromatina, la epigenética, los inhibidores de HDAC, modificationsThis histona es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial No Derivative Works 3.0 Unported License, que permite la distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y se acredite la fuente. Esta licencia no permite la explotación comercial o la creación de trabajos derivados sin el permiso específico.
IntroductionIntroduction
Comienzo de la página de la arquitectura PageLas de la cromatina eucariótica es de vital importancia para la regulación de la expresión génica. Los cambios locales en la estructura de la cromatina afecta a la actividad transcripcional y dinámicamente modulada por modificaciones post-traduccionales de las proteínas histonas (revisado en Jenuwein y Allis, 2001). acetilación reversible de las colas N-terminal es una de las modificaciones de las proteínas más estudiadas después de la traducción. Acetilación de las histonas mediada por acetiltransferasas histonas se asocia generalmente con la activación transcripcional, mientras que la desacetilación de histonas-catalizada por la histona deacetilasa (HDAC)-por lo general conduce a la represión de la transcripción (revisado en Wade, 2001). Dieciocho HDAC mamíferos han sido identificados hasta la fecha y se clasifican de acuerdo a su homología con desacetilasas levadura (revisado en Mariadason, 2008): clase Rpd3-como yo (HDAC1, 2, 3 y 8), clase-como hda1 IIa (HDAC4, 5, 7 y 9) y la clase IIb (HDAC6 y 10), Sir2-como la clase III (SIRT1-7), y la clase IV (HDAC11). Además de las histonas, HDAC también deacetylate proteínas no histonas, incluyendo factores de transcripción, supresores de tumor, los mediadores de transducción de señales, y los componentes del citoesqueleto (revisado en Lin et al, 2006; Glozak y Seto, 2007; Spange et al, 2009).
HDAC tienen un papel crucial en la regulación de una variedad de procesos biológicos, incluyendo la progresión del ciclo celular, proliferación, diferenciación y desarrollo (revisado en Haberland et al, 2009b). En los últimos años, también se ha convertido cada vez más evidente que las HDAC están involucrados en la patogénesis del cáncer (revisado en Weichert, 2009). En consecuencia, los inhibidores de HDAC han atraído considerable atención como posibles fármacos contra el cáncer. inhibidores de la HDAC selectivamente inducir detención del crecimiento, diferenciación y / o apoptosis en líneas celulares transformadas y de los animales portadores de tumor (revisado en Bolden et al, 2006; Marcas y Xu, 2009). Varios inhibidores de la HDAC están actualmente a prueba en fase I / II de ensayos clínicos para determinar su eficacia como agentes anti-cáncer, y el ácido suberoilanilida inhibidor de HDAC hidroxámico fue recientemente aprobado por la FDA para el tratamiento del linfoma cutáneo de células T (Mann et al, 2007 y revisado en Marcas y Xu, 2009). La mayoría de los inhibidores de HDAC descritos hasta el momento inhiben múltiples clase I, II, IV y isoformas de HDAC, y la HDAC objetivo clave de estos fármacos en la terapia del cáncer aún no han sido identificados (revisado en Balasubramanian et al, 2009; Witt et al 2009,). La comprensión de la relevancia de las HDAC específico en la génesis tumoral, sin embargo, han obtenido de estudios de la pérdida de función en las células y modelos animales, y desde el análisis de la expresión de HDAC en varios tipos de cánceres humanos (al Ozdag y otros, 2006; Nakagawa et al, 2007; Zimmermann et al, 2007; Jin et al, 2008; Haberland et al, 2009b; Weichert, 2009).
La clase I HDAC1 enzima es esencial para el desarrollo de embriones de ratón (al Lagger y otros, 2002, Montgomery et al, 2007; Yamaguchi et al, 2010) y la proliferación sin restricciones de la madre embrionarias (ES) células (Lagger y otros, 2002), y participa en la diferenciación de las células epiteliales (revisado en Brunmeir et al 2009,). La gran homología de clase I y enzimas HDAC1 HDAC2 son capaces de homo-y heterodimerise y con frecuencia se reclutó a los complejos represor que indicaban funciones similares o coincidentes en parte (al Hassig y otros, 1998; Taplick et al, 2001). Sin embargo, un estudio realizado con ratones knock-out convencionales identificados que la pérdida de HDAC1 resultados en un fenotipo pleiotrópico acompañada de tasas de reducción de la proliferación y la letalidad embrionaria antes embrionarias E9.5 día (Lagger y otros, 2002). Curiosamente, HDAC2 está regulado en los embriones HDAC1 deficiente y células madre embrionarias, pero no puede, obviamente, para compensar la pérdida de HDAC1 (al Lagger y otros, 2002; Zupkovitz et al, 2006). En contraste, tres estudios del ratón knockout para el informe HDAC2 no letalidad embrionaria (Trivedi et al, 2007; Zimmermann et al, 2007; Yamaguchi et al, 2010), subrayando el papel fundamental de HDAC1 durante el desarrollo embrionario y sugiriendo funciones no redundante para ambos enzimas en varios casos. Supresión de cualquiera de HDAC1 o HDAC2 en una amplia gama de tejidos no afecta a la viabilidad, pero la pérdida de los cuatro alelos Hdac1/Hdac2 conduce a graves fenotipos específicos de tejido (Montgomery et al, 2007, 2009). Sin embargo, el mecanismo molecular exacta de HDAC1 HDAC2 y cruz-regulación sigue siendo un tema de debate.
observaciones acumuladas indican también que HDAC1 está implicada en la patogénesis del cáncer, y es un objetivo fundamental para los inhibidores de HDAC en la terapia del cáncer. Incremento en la expresión HDAC1 se ha informado en una variedad de cánceres humanos, como el de mama (Krusche et al, 2005), colon y colorrectal (Giannini y Cavallini, de 2005, Huang et al, 2005; Wilson et al, 2006; Ishihama et al, 2007 ; Weichert et al, 2008c; Thangaraju et al, 2009), de endometrio (Weichert et al, 2008a), estómago (Choi et al, 2001; Kim et al, 2004), hepatocelular (Rikimaru et al, 2007), páncreas (Wang et al, 2009), próstata (Patra et al, 2001; al Halkidou y otros, 2004; Weichert et al, 2008b), y de ovario (Jin et al, 2008; Weichert et al, 2008a) tipos de cáncer. Un número de estudios de la precipitación utilizando ARN de interferencia pequeños han demostrado que la pérdida de HDAC1 conduce a la reducción de la proliferación, la detención del ciclo celular e inducción de la apoptosis en una variedad de líneas celulares tumorales humanas (Glaser et al, 2003; Senese et al, 2007; Thangaraju et al, 2009), lo que indica que HDAC1 es esencial para la supervivencia de las células tumorales. Diferenciación celular se informó en líneas celulares de cáncer de mama humano tras la baja regulación de HDAC1 (Zhou et al, 2000), por lo tanto HDAC1 expresión se correlaciona con la diferenciación del tumor pobres en varios cánceres humanos (Rikimaru et al, 2007; Wang et al, 2009; Weichert , 2009). Una posible participación de HDAC1 en la formación de linfoma y leucemia (Minucci et al, 2000; Amann et al, 2001), la progresión del cáncer de mama (Kawai et al, 2003; Suzuki et al, 2009), la angiogénesis tumoral (Kim et al, 2001) , invasión tumoral y metástasis (Peinado et al, 2004; von Burstin et al, 2009) la resistencia, y el tumor con el estrés oxidativo (Kato et al 2009), ha sido reportado.
Para evaluar el papel de HDAC1 en la formación de tumores, que inducida experimentalmente teratomas (es decir, tumores de células germinales) en ratones inmunodeficientes. Se presenta por primera vez que la deficiencia de HDAC1 conduce a la formación de carcinomas indiferenciados parcialmente embrionario en un sistema de teratoma modelo murino. Este fenotipo se acompaña de regulación de HDAC2, el más cercano homólogo de HDAC1. Por el contrario, los tumores derivados de células madre embrionarias de tipo salvaje son muy diferenciados y muestran una menor proliferación. Estos resultados pueden explicarse por la pérdida de la represión HDAC1 mediada por el gen snail1 en HDAC1-/ - los tumores. Como consecuencia de expresión SNAIL1 elevada, la E-cadherina es deslocalizada, lo que lleva a la pérdida de uniones celulares y la reducción de las estructuras epiteliales. Cabe destacar que el fenotipo murino se reflejó en las muestras de pacientes humanos. Al igual que el modelo de ratón teratoma, HDAC1 se expresó en muy maduro (diferenciado) muestras de pacientes humanos, mientras que HDAC2 se encuentra sobreexpresada en inmaduras (no diferenciadas) muestras. Estos resultados sugieren que HDAC1 y HDAC2 podrían representar valiosos marcadores de pronóstico para la clasificación de carcinoma en el futuro.
Resultados
Principio de la pageHDAC1 + / + y HDAC1-/ - células madre embrionarias forma teratomas
Varias publicaciones recientes sugieren que las funciones de HDAC en la formación y progresión del cáncer (Ozdag et al, 2006; Nakagawa et al, 2007). Sin embargo, el mecanismo exacto de acción o que los miembros de la clase I de la familia de HDAC participar en la aparición de cáncer, no se han aclarado hasta el momento. El golpe de gracia convencional de HDAC1 en ratones revelaron los tipos reducidos de la proliferación de embriones de ratón y células madre embrionarias identificar HDAC1 como un importante regulador de la proliferación celular (Lagger y otros, 2002). Para evaluar la contribución de HDAC1 a la formación de cáncer, que hizo uso de un tumor común y un sistema de diferenciación que es la generación de los teratomas en ratones inmunodeficientes. Por lo tanto, ya sea HDAC1 de tipo salvaje (HDAC1 + / +) o golpe de gracia (HDAC1-/ -) células madre embrionarias fueron inyectados por vía subcutánea en SCID / BALBc ratones hembra y un seguimiento cada 4 días (para una lista de todas las inyecciones véase el cuadro complementario S1). Como controles, se utilizó HDAC1 restablecido (HDAC1-/-re) y vacío de vectores infectados (HDAC1-/-ev) nocaut en las células del ES como se describió previamente (Zupkovitz et al, 2006). masas palpables tumor se desarrolló normalmente en los sitios de inyección dentro de 4 a 16 días en el caso de HDAC1 + / + y HDAC1-/ - células madre embrionarias y de 4 a 12 días para HDAC1-/-re y HDAC1-/-ev células madre embrionarias (Suplementario S1A Figura). Curiosamente, todas las líneas de células madre embrionarias inyectadas llevado al desarrollo de tumores, lo que indica que el inicio y la formación de teratomas primaria es independiente de la presencia de HDAC1. Cuando los tumores alcanzaron un volumen estimado de 1000-1500 mm3, los ratones murieron y teratomas de todos los genotipos fueron removidos, medidos y pesados. A pesar de una tendencia a que los teratomas derivados de HDAC1 células madre embrionarias mutantes para desarrollar más lentamente y ser más pequeños que los teratomas derivadas de células embrionarias de tipo salvaje se notó, sin diferencias estadísticamente significativas (t de Student: p-valor> 0,05) se observó en cualquier punto de tiempo entre el volumen estimado de los teratomas derivados de HDAC1 de tipo salvaje y mutante HDAC1 células madre embrionarias (Figura 1). El volumen de los tumores de los teratomas como resultado de la inyección de células madre embrionarias HDAC1-/-ev fue ligeramente mayor en comparación con el tamaño de los teratomas HDAC1-/-re (Suplementario figura S1). En el caso de todos los teratomas analizados, ningún signo de aparición de metástasis o invasión de tejidos adyacentes fue detectada en el transcurso del experimento. Los teratomas se mantuvo localizado en el sitio de la inyección de células ES y no parecía afectar a la salud de los ratones de acogida (datos no presentados).
FIGURA 1
Figura 1.HDAC1-/ - teratomas revelan la proliferación elevada y aumento de la apoptosis. En total, 3 × 106 células madre embrionarias de ratón de tipo salvaje y HDAC1 deficientes fueron inyectados por vía subcutánea en ratones SCID / Balb / c, y la formación de teratomas, así como el tamaño del tumor fue monitoreado cada 4 días. Receptor ratones SCID fueron asesinados después de 28 días después de la inyección y los teratomas de ambos genotipos fueron retirados y analizados. (A) La comparación estadística del volumen del tumor de HDAC1 + / + (barras de color negro) y HDAC1-/ - (barras blancas) teratomas. El volumen del tumor (mm3) se calculó mediante la fórmula '(width2 longitud x) x ½ ". (B) Análisis de Western blot de extractos proteicos de células madre embrionarias utilizadas para la inyección y tres individuales HDAC1 + / + (carriles 1-3) y HDAC1-/ - teratomas (carriles 4-6). La membrana se probaron con anticuerpos contra HDAC1, HDAC2 y actina se utilizó como control de carga. (C-E) El análisis de IHQ de representante HDAC1 + / + y HDAC1-/ - cortes de parafina teratoma. Los núcleos fueron contrastados con hemalaun Mayer (coloración azul). Para la cuantificación, las células teñidas positivamente fueron evaluados por el Software HistoQuest como se muestra en los gráficos de la derecha. (C) IHQ con anticuerpos contra HDAC1 y HDAC2 (rojo AEC manchas). Todas las imágenes fueron tomadas en una × 20 aumentos. (D) IHC con el marcador de proliferación Ki67 antígeno (AEC mancha roja paneles, superior) y el marcador de apoptosis caspasa 3 (rojo AEC mancha paneles inferiores). Todas las imágenes se tomaron en un × 40 aumentos. (E) HDAC1 + / + y HDAC1-/ - secciones teratoma se analizaron mediante el ensayo de la apoptosis TUNEL (fluorescencia verde) y por IHQ con anticuerpos p53. Todas las imágenes fueron tomadas en una × 20 aumentos. * P <0,05, ** p <0,01; *** P <0.001.
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En el siguiente experimento, se examinaron los niveles de expresión de HDAC1 y sus más cercanos HDAC2 homólogo en los teratomas por análisis de Western blot (Figura 1B; suplementario figura S1B). Previamente hemos observado una regulación de HDAC2 en HDAC1 células madre embrionarias mutantes (Lagger y otros, 2002). Como era de esperar, HDAC1 estuvo ausente en los teratomas generados a partir de HDAC1-/ - células y HDAC1-/-ev ES, mientras que HDAC2 se encontró que hasta reguladas. Con el fin de estudiar la composición del tejido de los teratomas de genotipos diferentes, los tumores fueron incluidas en parafina y seccionadas. Otra confirmación de que HDAC1 es indetectable en HDAC1 teratomas mutante se logró mediante inmunohistoquímica (IHC) experimentos, revelando que la expresión HDAC1 se redujo en aproximadamente un 80% en comparación con teratomas de tipo salvaje (Figura 1C). En HDAC1-/ - teratomas, una pequeña minoría de las células (2%) retenido HDAC1 expresión. Estas células HDAC1-se detectaron casos positivos para formar los vasos sanguíneos o que emigraron a las células inmunes. Por lo tanto, sugieren que estas células originalmente descienden desde el ratón de acogida y no se derivan de las líneas de células inyectadas ES. De acuerdo con los análisis de Western blot, que se encuentran sobreexpresados HDAC2 en la pérdida de HDAC1 en tinciones IHC (Figura 1C). El número de células positivas en HDAC2 HDAC1-/ - teratomas aumentó del 35 al 83% en comparación con los tumores de tipo salvaje.
Estos resultados muestran que la inyección de células madre embrionarias HDAC1 de tipo salvaje y mutante en ratones inmunodeficientes llevó a la formación de teratomas, pero inesperadamente no reveló ninguna diferencia estadísticamente significativa en el volumen tumoral y el comportamiento del crecimiento.
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